El butirato reduce la absorción celular de magnesio independientemente de la regulación metabólica en Caco - Tecnologías Co., Ltd de Guangdong BoldFrontier

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 18551 (2022) Citar este artículo

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Se ha demostrado que la digestión de las fibras dietéticas por parte de las bacterias intestinales estimula la absorción intestinal de minerales [p. ej., calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+)]. Aunque se ha sugerido que el pH local y las concentraciones de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) determinan la absorción de cationes divalentes, aún se desconocen los mecanismos moleculares exactos. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo determinar los efectos de los AGCC en la absorción intestinal de Mg2+. Mostramos que la concentración de butirato en el colon se correlaciona negativamente con los niveles séricos de Mg2+ en ratones de tipo salvaje. Además, el butirato de sodio inhibió significativamente la absorción de Mg2+ en las células Caco-2, mientras que la absorción de Ca2+ no se vio afectada. Aunque el butirato de sodio redujo significativamente la tasa de producción total de ATP y resultó en un aumento de la fosforilación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), la inhibición de la absorción de Mg2+ por el butirato precedió a estas consecuencias. Es importante destacar que los exámenes electrofisiológicos demostraron que el butirato intracelular reducía directamente la actividad del complejo de canales de Mg2+ heteromérico, el receptor potencial transitorio de melastatina (TRPM)6/7. El bloqueo de la captación de butirato celular evitó su efecto inhibitorio sobre la captación de Mg2+, lo que demuestra que el butirato actúa intracelularmente. Nuestro trabajo identificó al butirato como un nuevo regulador de la absorción intestinal de Mg2+ que funciona independientemente de la regulación metabólica. Este hallazgo destaca aún más el papel de la fermentación microbiana en la regulación de la absorción de minerales.

La absorción de magnesio (Mg2+) en los intestinos se ve facilitada por diferentes vías de absorción1. El transporte paracelular pasivo ocurre en el intestino delgado, mientras que el transporte activo en el colon es facilitado por los canales de la familia de canales de cationes de potencial receptor transitorio de melastatina (TRPM), TRPM6 y TRPM7, en el lado apical2,3, y la ciclina M4 (CNNM4) en el lado basolateral de los enterocitos4. Hasta el momento, se sabe poco sobre los factores que regulan la absorción intestinal de Mg2+.

La suplementación oral de Mg2+ a menudo es insuficiente para restaurar los niveles de Mg2+ en sangre en enfermedades con una mayor prevalencia de deficiencia de Mg2+, como la diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), la hipertensión, las enfermedades cardiovasculares y la hipomagnesemia inducida por inhibidores de la bomba de protones (IBP)5,6,7. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de opciones de tratamiento alternativas que estimulen la absorción intestinal de Mg2+. Dirigirse a la microbiota intestinal utilizando fibras dietéticas es una estrategia prometedora, ya que se demostró que la fermentación de las fibras dietéticas por parte de las bacterias intestinales mejora la absorción intestinal de Mg2+8,9. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes aún se desconocen.

Un posible mecanismo es que los ácidos grasos de cadena corta (AGCC; acetato, propionato y butirato), derivados de la fermentación bacteriana de carbohidratos dietéticos complejos, estén involucrados en el aumento de la absorción de Mg2+10. Cada vez hay más pruebas de que los AGCC actúan como moléculas clave de señalización entre la microbiota intestinal y el huésped10,11,12. De hecho, los SCFA fortalecen la integridad de la barrera de la mucosa, modulan las respuestas de las células inmunitarias y afectan el metabolismo del colesterol, los lípidos y la glucosa en varios tejidos12. En el contexto de la fisiología intestinal, el butirato se ha estudiado más intensamente por su papel como fuente de energía primaria para los colonocitos y sus efectos protectores contra la inflamación y el cáncer colorrectal13,14,15.

Las fibras prebióticas (p. ej., oligofructosa, inulina) aumentan la producción de AGCC y reducen el pH intraluminal del colon. Estos factores demostraron ser beneficiosos para la solubilidad y absorción de Mg2+ en diferentes modelos experimentales8,16,17. Como tal, se supone que los efectos estimulantes de la microbiota intestinal sobre la absorción de Mg2+ dependen de los SCFA, ya sea por la acidificación de la luz intestinal o por la afectación de los mecanismos de transporte activo. Aunque estos conceptos han sido ampliamente adoptados en la literatura científica actual, los efectos directos de los SCFA sobre la absorción intestinal de Mg2+ nunca se han aclarado.

Este estudio investigó el papel fisiológico de los SCFA en la absorción intestinal de Mg2+ al dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales los SCFA modulan la captación de Mg2+ en la línea celular de colon humano Caco-2, y al correlacionar los niveles séricos de Mg2+ con las concentraciones de SCFA en el colon en ratones C57BL/6J de tipo salvaje.

Para evaluar si los SCFA derivados de la microbiota influyen en la homeostasis de Mg2+, se realizaron análisis de correlación entre las concentraciones de SCFA en el colon y los niveles séricos de Mg2+ en ratones C57BL/6J de tipo salvaje (Fig. 1). Medimos la concentración relativa de AGCC en muestras de colon que se recolectaron durante un estudio previo18. El análisis de regresión lineal mostró una correlación inversa significativa de las concentraciones de butirato colónico con los niveles séricos de Mg2+ (P < 0,05, r2 = 0,22) (Fig. 1A). No se encontraron correlaciones entre los niveles séricos de Mg2+ y las concentraciones colónicas de acetato o propionato (Fig. 1B,C). No se encontraron correlaciones entre las concentraciones de SCFA en el colon y los niveles séricos de Ca2+ (Figura complementaria S1).

Las concentraciones de butirato en el colon se correlacionan negativamente con los niveles séricos de Mg2+ en ratones. (A–C) Se realizaron análisis de regresión lineal simple en las concentraciones de SCFA en el colon, obtenidas de un conjunto de datos publicado previamente18, y los niveles séricos de Mg2+ de 25 ratones C57BL/6J macho de tipo salvaje. Análisis de regresión lineal simple entre las concentraciones colónicas de butirato (y = −2,24x + 1,52, r2 = 0,22, P < 0,05) (A), acetato (y = −0,05x + 1,22, r2 = 0,006) (B), propionato ( y = 0,15x + 1,15, r2 = 0,003) (C), y niveles séricos de Mg2+. Los datos se trazan como puntos de datos individuales con la línea lineal que indica la relación. P < 0,05 se considera significativo.

Para explicar el mecanismo subyacente de la correlación inversa entre las concentraciones de butirato colónico y los niveles séricos de Mg2+, investigamos si el butirato afecta la absorción de Mg2+ en la línea celular de colon humano Caco-2 utilizando el isótopo pesado de 25 Mg. Las células incubadas durante 20 min con 2, 4 u 8 mmol/l de butirato de sodio tuvieron una absorción de 25Mg2+ significativamente menor en comparación con el control (100 % frente a 88 % ± 2 frente a 86 % ± 4 frente a 72 % ± 3, respectivamente , P < 0,05) (fig. 2A). Cabe destacar que también se observó un efecto dosis-respuesta dentro del rango de concentración fisiológica (8–40 mmol/L) (Figura complementaria S2)15. Se observó una reducción similar de la absorción de 25Mg2+ en las células incubadas con propionato de sodio y acetato de sodio (Figura complementaria S2). Se realizaron experimentos adicionales usando la concentración fisiológica baja de 8 mmol/L. El efecto inhibidor del butirato de Na dependía del tiempo, ya que 8 mmol/L de butirato de Na resultó en una absorción significativamente menor de 25Mg2+ entre 10 y 30 min en comparación con las células tratadas con control (P < 0,05) (Fig. 2B). La absorción de 45Ca2+ no fue inhibida por el tratamiento con butirato de Na en células Caco-2 (Fig. S2 complementaria). A continuación, se añadió butirato de Na (0–20 mmol/L) a un tampón que contenía verde de magnesio y MgCl2, para probar si el butirato de Na sería capaz de unirse al Mg2+ lo suficiente como para disminuir la fluorescencia mediada por la unión del verde de magnesio Mg2+. Ninguna de las concentraciones probadas de butirato de sodio resultó en una intensidad fluorescente más baja (Fig. 2C). Como control para nuestro ensayo, la adición de 1 mmol/L de ATP al tampón que contiene verde magnesio y MgCl2 redujo la fluorescencia verde magnesio al doble (98 % ± 10 frente a 46 % ± 18, P < 0,05) y 2 mmol/L ATP eliminó la fluorescencia por completo (Fig. 2D). Para determinar si los efectos del butirato dependían de las acciones intracelulares, la absorción de butirato a través del transportador de monocarboxilato 1 (MCT1) fue bloqueada por el conocido inhibidor de MCT1 floretina19. De forma similar a los experimentos anteriores, 20 min de incubación con 8 mmol/L de butirato de Na redujo significativamente la absorción de 25Mg2+ (100 % frente a 65 % ± 5, P < 0,05) y este efecto se eliminó mediante la adición de 1 mmol/L de floretina (65 % ± 5 vs 101% ± 10, P < 0,05) (Fig. 2E).

El tratamiento con butirato da como resultado una absorción reducida de 25Mg2+ en las células Caco-2. (A) Captación de 25Mg2+ por las células Caco-2 después de 20 min de tratamiento con concentraciones crecientes de butirato de Na (2–8 mmol/L). Los datos representan la media ± SEM (n = 3, cada experimento consistió en triplicados). *P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con las células de control utilizando ANOVA unidireccional con corrección de Dunnett para pruebas múltiples. (B) Evolución temporal de la absorción de 25 Mg2+ por parte de las células Caco-2 tratadas con 8 mmol/L de butirato de Na (línea discontinua) o control (línea continua) durante 30 min. Los datos representan la media ± SEM (n = 3, cada experimento consistió en triplicados). *P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con las células de control en el mismo momento utilizando la prueba t de Student. (C, D) Intensidad de fluorescencia de 2 µmol/L de verde magnesio en un tampón de MgCl2 de 1 mmol/L con concentraciones crecientes de butirato de sodio (0–20 mmol/L) (C) y ATP (0–2 mmol/L ) (D). Los datos representan la media ± SEM (n = 4 (C) y n = 3 (D), cada experimento consistió en duplicados). (E) Absorción de 25 Mg2+ por las células Caco-2 después de 20 min de tratamiento con 8 mmol/L de butirato de Na o 8 mmol/L de butirato de Na y 1 mmol/L de floretina. Los datos representan la media ± SEM (n = 3, cada experimento consistió en triplicados). *P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con las células de control utilizando ANOVA unidireccional con la corrección de Sidak para pruebas múltiples.

Dado que el butirato es la principal fuente de energía para los colonocitos20,21, planteamos la hipótesis de que el tratamiento con butirato da como resultado una menor captación de 25Mg2+ al modular el metabolismo celular (Fig. 3). Para investigar esto con más detalle, se examinaron los efectos del tratamiento con butirato sobre la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) y la glucólisis, las dos vías metabólicas principales responsables de la producción de ATP, utilizando el analizador Seahorse Xfe96. El tratamiento de las células con 8 mmol/L de butirato de Na disminuyó la tasa de acidificación extracelular (ECAR) (Fig. 3A) y aumentó la tasa de consumo de oxígeno (OCR) (Fig. 3B). La cuantificación de las tasas de producción de ATP demostró que el tratamiento con butirato dio como resultado una producción de ATP glucolítico significativamente menor (52,71 ± 2,55 frente a 42,95 ± 2,13 pmol de ATP/min/µg de proteína, P < 0,05) (Fig. 3C) y una mayor producción de ATP mitocondrial ( 23,70 ± 3,35 frente a 29,84 ± 3,17 pmol de ATP/min/µg de proteína, P < 0,05) (Fig. 3D). Juntos, el tratamiento con butirato dio como resultado una producción total de ATP significativamente menor (76,41 ± 2,06 frente a 72,79 ± 2,78 pmol de ATP/min/µg de proteína, P < 0,05) (Fig. 3E). Por el contrario, el tratamiento de las células con 8 mmol/L de acetato o propionato no afectó las tasas de producción total de ATP, pero dio como resultado una disminución de la producción de ATP mitocondrial y glucolítica (Fig. S3 complementaria).

El tratamiento con butirato da como resultado tasas más bajas de producción de ATP al modular el metabolismo celular. (A, B) Tasas de acidificación extracelular (ECAR) (A) y tasas de consumo de oxígeno (OCR) (B) de células Caco-2 tratadas con control (línea continua) o 8 mmol/L de butirato de sodio (línea discontinua) (primera flecha), seguido de oligomicina 2 µmol/L (bloquea OXPHOS como inhibidor de la ATP sintasa; segunda flecha) y una mezcla de 0,5 µmol/L de rotenona y antimicina A (bloquea OXPHOS como inhibidor del complejo mitocondrial I y III, respectivamente; tercera flecha ), medido con el analizador Seahorse Xfe96 y normalizado para controlar las células. Se muestran los resultados de un experimento representativo, los experimentos se repitieron por triplicado. Los datos representan la media ± SEM con 12 repeticiones por condición. (C–E) Tasa de producción de ATP glicolítico (C), mitocondrial (D) y total (C) de las células antes (basal) y después del tratamiento (inducido) con 8 mmol/L de butirato de sodio. Los datos representados en (C–E) representan la media ± SEM y se calculan a partir de trazas individuales de tres experimentos independientes, de las cuales las trazas representativas de un experimento se representan en (A, B). *P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con el basal utilizando la prueba t de Student pareada.

Para comprender mejor la reducción inducida por butirato en los niveles totales de ATP, analizamos los niveles de fosforilación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK). AMPK es el sensor maestro de energía de la célula y se fosforila en condiciones de ATP22 intracelular bajo. Las células Caco-2 se trataron con butirato de Na 8 mmol/L, glucosa 25 mmol/L (para estimular la producción de ATP) u oligomicina 2 µmol/L (para inhibir la producción de ATP) durante 5, 10 y 20 min.

En comparación con el control, el tratamiento con butirato tendió a dar como resultado una fosforilación de AMPK 1,2 veces mayor después de 5 minutos (no estadísticamente significativo), mientras que el tratamiento con oligomicina dio como resultado una fosforilación de AMPK casi dos veces mayor (Fig. 4A, D). Sin embargo, el tratamiento con butirato resultó en una fosforilación de AMPK significativamente mayor de casi 1,5 veces después de 10 min (Fig. 4B, E) y dos veces después de 20 min (Fig. 4C, F). De manera similar, el tratamiento con oligomicina dio como resultado una fosforilación de AMPK consistentemente más alta a los 10 (Fig. 4B, E) y 20 min (Fig. 4C, F). Viceversa, el tratamiento con glucosa, conocido por aumentar la producción de ATP, dio como resultado una fosforilación de AMPK más baja, que solo fue significativa después de 10 min (Fig. 4A-F). Una de las principales vías de señalización aguas abajo reguladas por AMPK es la vía de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR), que involucra a S6K como diana directa aguas abajo23. Dado que la AMPK activada inhibe la vía mTOR, se investigaron los niveles de fosforilación de S6K en los mismos momentos. No se observaron efectos del tratamiento con butirato, glucosa u oligomicina en la fosforilación de S6K después de 5 min (Fig. 4G, J). Sin embargo, el tratamiento con butirato resultó en una fosforilación de S6K significativamente menor del doble después de 10 min (Fig. 4H, K) y 2.5 veces después de 20 min (Fig. 4I, L). En este último punto de tiempo, el tratamiento con glucosa dio como resultado una fosforilación de S6K significativamente mayor de 1,5 veces (Fig. 4I, L). Todos los datos de Western blot sin procesar originales se muestran en la información complementaria (Figuras complementarias S4–S5).

El tratamiento con butirato afecta la señalización de AMPK. (A–C) Imágenes de inmunotransferencia representativas de pAMPK (62 kDa) y AMPK total (62 kDa) de lisados de células Caco-2 después del tratamiento con 8 mmol/L de butirato de sodio, 25 mmol/L de glucosa o 2 µmol/L de oligomicina durante 5 min (A), 10 min (B) y 20 min (C). (D–F) Análisis de densitometría de la expresión de pAMPK corregida para los niveles de expresión de AMPK total después de 5 min (D), 10 min (E) y 20 min (F) de tratamiento con 8 mmol/L de butirato de sodio, 25 mmol/L glucosa, o 2 µmol/L de oligomicina. (G-I) Imágenes de inmunotransferencia representativas de pS6K (70 kDa) y S6K total (70 kDa) de lisados de células Caco-2 después del tratamiento con 8 mmol/L de butirato de sodio, 25 mmol/L de glucosa o 2 µmol/L de oligomicina durante 5 min (G), 10 min (H) y 20 min (I). (J–L) Análisis de densitometría de la expresión de pS6K corregida para la expresión total de S6K después de 5 min (J), 10 min (K) y 20 min (L) de tratamiento con 8 mmol/L de butirato de sodio, 25 mmol/L de glucosa , o 2 µmol/L de oligomicina. Los datos representan la media ± SEM (n = 3, cada experimento consistió en triplicados). *P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con las células de control utilizando ANOVA unidireccional con corrección de Dunnett para pruebas múltiples. Todas las inmunotransferencias originales se presentan en las Figs. complementarias. S4–S5.

Para investigar si la inhibición de la absorción de Mg2+ inducida por el tratamiento con butirato dependía de la señalización de AMPK (Fig. 5), las células Caco-2 se trataron durante 5, 10 y 20 minutos con 8 mmol/L de butirato de Na y/o 2 mmol /LA AICAR, un conocido compuesto activador de AMPK24. Como se observó en experimentos anteriores, el tratamiento con butirato dio como resultado una absorción significativamente menor de 25Mg2+ en todos los puntos de tiempo (Fig. 5A–C). Sin embargo, el tratamiento con AICAR, que resultó en la activación de AMPK, no afectó la absorción de 25Mg2+ después de 5 min (Fig. 5A) y resultó en una mayor absorción de 25Mg2+ después de 10 min (Fig. 5B). Sin embargo, el tratamiento combinado con AICAR y butirato resultó en una captación significativamente menor de 25Mg2+ en comparación con el tratamiento solo con AICAR (Fig. 5A–C). Posteriormente, analizamos si los niveles intracelulares bajos de ATP inhibían directamente la captación de 25Mg2+ al tratar las células con oligomicina durante 5, 10 y 20 min. Mientras que 5 min de tratamiento con butirato dieron como resultado una captación de 25Mg2+ significativamente menor de casi 1,5 veces, no hubo efectos de 5 min de tratamiento con oligomicina (Fig. 5D). Después de 10 y 20 min, el tratamiento con butirato y oligomicina dio como resultado una captación de 25Mg2+ significativamente menor (Fig. 5E).

El tratamiento con butirato reduce la absorción de 25Mg2+ independientemente del ATP. (A–C) Captación de 25 Mg2+ por las células Caco-2 después del tratamiento con 8 mmol/L de butirato de Na y/o 2 mmol/L de AICAR durante 5 min (A), 10 min (B) y 20 min (C). Los datos representan la media ± SEM (n = 3, cada experimento consistió en triplicados). *P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con las células de control utilizando ANOVA unidireccional con la corrección de Sidak para pruebas múltiples. (D–E) Absorción de 25 Mg2+ por las células Caco-2 después del tratamiento con 8 mmol/L de butirato de Na o 2 µmol/L de oligomicina después de 5 min (D). Evolución temporal de la captación de 25Mg2+ por las células Caco-2 después del tratamiento con 8 mmol/L de butirato de Na o 2 µmol/L de oligomicina a los 5, 10 y 20 min (E). Los datos representan la media ± SEM (n = 3, cada experimento consistió en triplicados). *P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con las células de control en el mismo momento utilizando ANOVA unidireccional con la corrección de Dunnett para pruebas múltiples.

Posteriormente, se investigaron los posibles efectos directos del butirato en la absorción de Mg2+ (Fig. 6). Durante la última década, los canales heteroméricos TRPM6/7 se han establecido como los principales reguladores de la absorción de Mg2+ en el colon2,3. Para explorar si TRPM6/7 está involucrado en la absorción de Mg2+ inhibida por el tratamiento con butirato, las células Caco-2 se trataron con 8 mmol/L de butirato de Na y el inhibidor de TRPM6/7 NS8593 (30 µmol/L) durante 10 minutos3. Es importante destacar que el tratamiento de las células Caco-2 con butirato y NS8593 dio como resultado una absorción de 25Mg2+ cuatro veces menor (100 % frente a 24 % ± 2, P < 0,05), similar al efecto de NS8593 solo. Esto sugiere que el tratamiento con butirato está ejerciendo su efecto a través de TRPM6/7 (Fig. 6A). Por lo tanto, investigamos si el butirato podría afectar directamente la actividad del canal TRPM6/7. Células de riñón embrionario humano (HEK293) transfectadas transitoriamente con TRPM6/7, se sometieron a pinzamiento de parche de células completas usando butirato de Na 8 mmol/L en la solución de pipeta de parche. Las células expuestas al butirato de sodio intracelular presentaron densidades de corriente significativamente más bajas a lo largo del tiempo a + 80 mV y – 80 mV, en comparación con el control (759 ± 159 frente a 433 ± 53 pA/pF, P < 0,05 y − 45 ± 10 frente a − 18 ± 4 pA/pF, P < 0,05, respectivamente) (Fig. 6B,C). Es de destacar que los efectos del butirato de sodio intracelular dieron como resultado específicamente densidades de corriente más bajas de TRPM7, ya que las densidades de corriente de TRPM6 no se vieron afectadas (Fig. S6 complementaria). Todos los rastros originales de los registros electrofisiológicos se representan en la información complementaria (Figuras complementarias S7–S9).

El butirato intracelular da como resultado una menor actividad del canal TRPM6/7. (A) Captación de 25Mg2+ por las células Caco-2 después del tratamiento con 8 mmol/L de butirato de Na y/o 30 µmol/L de NS8593 después de 10 min. Los datos representan la media ± SEM (n = 3, cada experimento consistió en triplicados). * P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con las células de control utilizando ANOVA unidireccional con la corrección de Sidak para pruebas múltiples. (B, C) Corrientes de células enteras medidas a - 80 mV y + 80 mV a lo largo del tiempo en células HEK293 transfectadas con TRPM6/7 (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP y HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) HEK293 sin (círculos, n = 9 ) o con 8 mmol/L de butirato de Na (cuadrados, n = 11) en la solución de pipeta intracelular (B). Gráficos de barras de amplitudes de corriente sin (Control) o con 8 mmol/L de butirato de Na (butirato de Na) en la solución de pipeta intracelular (C). Los datos representan la media ± SEM. *P < 0,05 se considera estadísticamente significativo en comparación con las células de control utilizando la prueba t de Student.

Nuestro estudio demuestra que el butirato, un ácido graso de cadena corta derivado de la fermentación bacteriana, reduce la absorción intestinal de Mg2+ mediada por TRPM6/7 que precede a los cambios en la regulación metabólica. Esta conclusión se basa en los siguientes resultados: (i) las concentraciones de butirato colónico se correlacionan negativamente con los niveles séricos de Mg2+ en ratones de tipo salvaje; (ii) el tratamiento con butirato da como resultado una menor captación de 25Mg2+ en la línea celular de colon humano Caco-2; (iii) el tratamiento combinado de las células Caco-2 con butirato y floretina, un inhibidor específico del transportador de butirato MCT1, evita esta menor captación de 25Mg2+; (iv) el tratamiento de células Caco-2 con butirato y NS8593, un bloqueador de TRPM6/7, da como resultado una captación de 25Mg2+ cuatro veces menor, similar al tratamiento de células Caco-2 con NS8593 solo; (v) el butirato intracelular da como resultado una actividad del canal TRPM6/7 significativamente menor.

La fermentación de los carbohidratos de la dieta por parte de la microbiota intestinal se asocia con una mayor absorción de minerales25. En el colon humano se producen acetato, propionato y butirato en una relación molar de aproximadamente 60:20:20 con concentraciones que oscilan entre 20 y 140 mmol/L10,26. El acetato y el propionato son moduladores importantes del metabolismo de los lípidos, la glucosa y el colesterol en varios tejidos, mientras que el butirato ejerce funciones sistémicas limitadas pero es un modulador importante de la homeostasis del colon10,15,25. Aquí, informamos que solo las concentraciones de butirato en el colon, pero no el acetato y el propionato, se correlacionaron con los niveles séricos de Mg2+ en ratones C57BL/6J de tipo salvaje. En el colon, el butirato es la principal fuente de energía para los enterocitos y actúa como inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC)15. Estas funciones dependen de la absorción de butirato por los transportadores de monocarboxilato (p. ej., MCT1)26,27. Ahora demostramos que el butirato da como resultado una captación reducida de 25Mg2+ a través de mecanismos intracelulares, ya que la floretina, un inhibidor específico del transportador de butirato MCT1, suprime el efecto inhibidor del butirato sobre la captación de 25Mg2+. Específicamente, nuestros resultados sugieren que el butirato intracelular inicia un mecanismo de retroalimentación negativa para la captación de 25Mg2+ mediante la inhibición de los canales TRPM6/7.

Mostramos mediante experimentos de pinzamiento de parche de células enteras que el butirato intracelular resultó en corrientes TRPM6/7 1,5 veces más bajas en comparación con las células no tratadas. Los ácidos grasos se han informado previamente como moduladores intracelulares de la actividad de los canales iónicos y pueden actuar como (anta) agonistas en los canales del receptor de potencial transitorio (TRP)28,29,30,31. Se ha demostrado que los ácidos grasos poliinsaturados, incluidos el ácido araquidónico, el ácido eicosapentaenoico (EPA) y el ácido docosahexaenoico, inhiben las corrientes TRPM8 en las células de ovario de hámster chino32. Además, 40 µmol/L de ácido linoleico (LA) redujeron significativamente las corrientes en los potenciales de membrana negativos y positivos de los canales TRPM8 y TRPV1 en las células S2 de Drosophila33. De manera similar, 10 µmol/L de LA y EPA inhibieron las corrientes evocadas por capsaicina de TRPV1 en un 82 % y un 48 % en células HEK293, respectivamente34. Estos ácidos grasos inhibieron competitivamente las corrientes de TRPV1 provocadas por ligandos (p. ej., capsaicina), lo que sugiere un sitio de unión común34. Aunque estos estudios han investigado los ácidos grasos de cadena larga, nuestros datos sugieren un mecanismo similar para el butirato SCFA.

En general, se consideran dos mecanismos para explicar los efectos del butirato sobre la actividad de TRPM6/7: los SCFA pueden unirse directamente al canal o afectar la bicapa lipídica28,35. El butirato actúa como ligando de los receptores acoplados a proteína G (GPCR), como GPR43 (FFAR2), en las células epiteliales intestinales10,13. La activación de GPR43 por butirato estimula la actividad de la fosfolipasa C (PLC), que a su vez convierte el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3)36. Dado que la actividad de TRPM7 está regulada negativamente por la hidrólisis de PIP237,38,39, podría plantearse la hipótesis de que el butirato inhibe indirectamente la actividad de TRPM7 mediante la hidrólisis de PIP2 a través de la activación de GPR43 en la membrana de la superficie celular. Sin embargo, este mecanismo es poco probable, ya que el efecto inhibidor del butirato en el canal TRPM6/7 fue específico para la aplicación de butirato intracelular. La regulación negativa de la actividad de TRPM6/7 por butirato podría ser causada por la interacción directa con el canal, o vía regulación indirecta a través de vías inhibidoras como la vía PKC/RACk140. Por lo tanto, los estudios estructurales son necesarios para identificar si existen sitios de interacción de butirato dentro de los canales TRPM6/7.

Aunque mostramos que la captación reducida de Mg2+ mediada por butirato precede a los efectos del tratamiento con butirato en la regulación metabólica, no podemos excluir que los niveles reducidos de ATP contribuyan al efecto inhibitorio a largo plazo del tratamiento con butirato sobre la captación de 25Mg2+. Aunque la inhibición dependiente de butirato de la captación de 25Mg2+ precedió a los efectos del tratamiento con butirato sobre la producción de ATP, el bloqueo de la producción de ATP mediante el tratamiento con oligomicina también resultó en una captación de 25Mg2+ significativamente menor después de 10 y 20 min. En estos puntos de tiempo, el tratamiento con butirato y oligomicina dio como resultado una fosforilación significativamente mayor de AMPK, lo que confirma un estado intracelular de ATP bajo. Esta inhibición es similar a la observada con fármacos activadores de AMPK, como la metformina41. Una preincubación de 24 h con metformina o AICAR redujo significativamente la captación de 25Mg2+ en células Caco-2 y en la línea celular renal mDCT1541. Nuestros resultados demuestran que los niveles bajos de ATP intracelular se acompañan de una absorción reducida de Mg2+. Por lo tanto, el butirato puede desempeñar un papel doble en la reducción de la captación de Mg2+ al afectar la actividad de TRPM6/7 de forma aguda y al reducir los niveles de ATP intracelular en una respuesta tardía.

Nuestros resultados sugieren que el butirato proporciona un mecanismo de retroalimentación negativa para la absorción colónica de Mg2+ tras la ingesta de fibra dietética. Se sabe que las fibras dietéticas acidifican la luz intestinal y, por lo tanto, aumentan la solubilidad del Mg2+ en el colon8,9,16,17,42. Cuando la concentración de Mg2+ ionizado luminal es mayor, la permeabilidad de Mg2+ en el colon debe reducirse para mantener estable la absorción de Mg2+. Dado que las fibras dietéticas también aumentan la diversidad microbiana y, posteriormente, la producción de butirato43,44, el butirato proporciona una excelente molécula de señalización para reducir la actividad del canal de Mg2+. Dado que hay una oscilación de las concentraciones de butirato en la fermentación de la fibra dietética45,46, los canales TRPM6/7 no se inhibirán constantemente. Teniendo en cuenta que la absorción de Mg2+ a través de los canales TRPM6/7 es alta en el colon proximal y que este segmento intestinal está dominado por bacterias productoras de butirato10,47,48, el butirato podría actuar como regulador negativo de la absorción de Mg2+ en este segmento. Aunque la suplementación con butirato no resultó en diferencias en la concentración sérica de Mg2+ o la extrusión fecal de Mg2+ entre los ratones tratados con butirato y los de control después de 1 y 14 días de tratamiento en un estudio anterior49, nuestros análisis de correlación demostraron que el contenido de butirato colónico está inversamente asociado con el contenido sérico de butirato. Niveles de Mg2+ en un entorno fisiológicamente relevante.

Nuestro estudio es el primero que arroja información molecular sobre cómo los SCFA influyen en la absorción intestinal de Mg2+. Mostramos que el tratamiento con butirato da como resultado una disminución de la captación de 25Mg2+ mediante la inhibición rápida de los canales TRPM6/7, lo que precede a las consecuencias metabólicas. En particular, los pacientes con deficiencia de Mg2+ pueden beneficiarse de una relación molar baja de butirato para mejorar de manera óptima la absorción de Mg2+.

Las concentraciones de electrolitos en suero y las concentraciones de ácidos orgánicos del contenido del colon (caldo de fermentación) se determinaron en ratones C57BL/6J macho de tipo salvaje descritos en detalle por Gommers et al.18. Este estudio fue aprobado por la junta de ética animal de la Universidad Radboud Nijmegen (RU DEC 2015-0112) y por la Comisión Central Holandesa de Experimentos con Animales (CCD, AVD103002016382). Este estudio se realizó de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Este estudio se realizó de conformidad con las directrices ARRIVE.

Las concentraciones de ácidos orgánicos se determinaron en el contenido colónico (caldo de fermentación) de ratones. En resumen, el contenido colónico se diluyó cuatro veces con 1 mol/L de ácido perclórico (HClO4, Sigma-Aldrich, EE. UU.) para liberar los ácidos orgánicos. Las proteínas y la grasa del caldo de fermentación se precipitaron mediante ultrasonicación y se eliminaron mediante centrifugación durante 10 min a 20.000 xg. Los ácidos orgánicos, incluidos los SCFA, se determinaron mediante cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC) con detección de índice de refracción (IR) y UV. Se inyectaron 25 µL del sobrenadante en una precolumna en serie con dos columnas analíticas H+ de ácidos orgánicos Rezex ROA (Phenomenex, EE. UU.). Los ácidos orgánicos se eluyeron isocráticamente con 5 mmol/L de ácido sulfúrico (H2SO4), con un caudal de 0,60 mL/min. El horno de columna se mantuvo a una temperatura de 60 °C. El análisis de datos se realizó con el software Chromeleon versión 7.2 (Thermo Scientific). Los análisis cuantitativos se realizaron utilizando estándares de los ácidos orgánicos (Sigma-Aldrich, EE. UU.).

Las concentraciones séricas de Mg2+ se determinaron utilizando un kit de ensayo colorimétrico de xilidil-IL azul, según el protocolo del fabricante (Roche/Hitachi, Tokio, Japón) y se midieron a 600 nm en un espectrofotómetro de microplacas Bio-Rad Benchmark Plus (BioRad, Hercules, California, EE. EE.UU). Los niveles séricos de Ca2+ se midieron utilizando el método de o-cresolftaleína complexona50. Brevemente, se incubó el reactivo de color o-cresolftaleína (Sigma, Zwijndrecht, Países Bajos) con las muestras y los estándares y se midió inmediatamente la absorbancia a 570 nm. Las mediciones de Mg2+ y Ca2+ se realizaron utilizando Precinorm U (Roche, Basilea, Suiza) como control.

La línea celular de carcinoma humano Caco-2 (ATCC® HTB-37™, paso número 4–21) se mantuvo en medio de Eagle modificado por Dulbecco con 25 mmol/L de HEPES y 4,5 g/L de glucosa (DMEM, Lonza, Bélgica), complementado con 4 mmol/L de l-Glutamina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, EE. UU.), 5 % (v/v) de suero fetal bovino (FBS, HyClone, GE Healthcare Life Sciences, Illinois, EE. UU.), 1 % (v/v) ) aminoácidos no esenciales (Biowest, MO, EE. UU.) y penicilina-estreptomicina al 1 % (v/v) (Gibco, Nueva York, EE. UU.). Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 % (v/v) y se cultivaron durante 21 días o se indicó lo contrario. El medio de cultivo se cambió cada dos días y las células se pasaron una vez por semana cuando se alcanzó una confluencia de aproximadamente el 80%. Las células se sembraron a una densidad de 0,5 × 105 células por cm2. Células de riñón embrionario humano (HEK293; ATCC®-1573™, pase número 11–18) se cultivaron en DMEM suplementado con 10 % (v/v) de FBS, 10 µl/ml de aminoácidos no esenciales y 2 mmol/l·l -Glutamina.

El efecto del butirato de Na sobre la unión de Mg2+ se investigó utilizando la sal de pentapotasio verde de magnesio impermeable a las células (Life Technologies, Oregón, EE. UU.). Se prepararon soluciones madre de verde magnesio de 100 µmol/L en MQ. El tampón de trabajo contenía 2 µmol/L de colorante verde magnesio, 115 mmol/L de KCl, 20 mmol/L de NaCl, 0,1 mmol/L de EGTA y 10 mmol/L de Tris-HCL, pH 7,2. Las afinidades de colorante para Mg2+ se probaron primero en ausencia de butirato de sodio en el rango de concentración de 0–10 mmol/L de MgCl2, lo que arrojó una Kd de ~ 1,0 mmol/L (curva estándar, datos no mostrados). Posteriormente, se añadió butirato de Na, en el rango de 0-20 mmol/L, al tampón de trabajo (osmolaridad ajustada con NaCl). La fluorescencia se midió en un Tecan I-control Infinite200 pro (Thermo Fisher Scientific) a una absorción de 500 nm y una emisión de 535 nm.

La absorción de Mg2+ por las células Caco-2 se determinó utilizando el isótopo estable de 25 Mg (Cortecnet, Voisins Le Brettoneux, Francia). Utilizamos el isótopo estable no radiactivo 25Mg (abundancia natural 10%), que se puede distinguir de 24Mg (abundancia natural 80%) y 26Mg (abundancia natural 10%). Con este fin, las células se deplecionaron de Mg2+ y suero durante la noche. Al comienzo del experimento, las células se lavaron una vez con un tampón de captación básico precalentado (en mmol/L): 125 NaCl, 5,0 KCl, 0,5 CaCl2, 0,5 Na2HPO4, 0,5 Na2SO4, 15 HEPES, pH 7,5 ajustado con NaOH. A continuación, se añadieron a las células 500 µl de tampón de captación básico que contenía 1,0 mmol/l de 25MgO. En cada momento, las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada y se lisaron en HNO3 (≥ 65 %; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) a 65 °C durante 15 min. La captación de 25Mg2+ por las células se determinó mediante análisis de espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) (Facultad de Ciencias, Universidad de Radboud, Nijmegen). Los cálculos se realizaron en base a la relación normalizada entre 25 Mg y Mg total (24 Mg + 25 Mg + 26 Mg) (un aumento de 25 Mg intracelular cambiará la relación isotópica en comparación con su abundancia normal).

Las células Caco-2 se pretrataron con 25 µmol/L BAPTA-AM (1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,Nʹ,Nʹ-éster acetoximetílico del ácido tetraacético) (Invitrogen, Eugene, EE. UU.) para 30 minutos a 37 °C. Luego, las células se lavaron una vez con tampón de bicarbonato (KHB) Krebs-Henseleit tibio (en mmol/L): 110 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 Na-acetato, 2 NaHPO4 y 20 HEPES, pH 7,4 ( NaOH), seguido de 10 min de incubación con tampón KHB suplementado con inhibidores de los canales de calcio dependientes de voltaje, 10 μmol/L de felodipina y 10 μmol/L de verapamilo, y 1 μCi/mL de 45Ca (lote: 17M431A, Perkin Elmer, MA, EE. UU. ) a 37 °C. Posteriormente, el ensayo se detuvo lavando las células tres veces con tampón KHB enfriado con hielo complementado con 0,5 mmol/l de CaCl2 y 1,5 mmol/l de LaCl3. Las células se recolectaron en solución de SDS al 0,05 % (v/v), mezcladas con Opti-Flour O (Perkin Elmer, MA, EE. UU.). A continuación, se cuantificó la captación de 45Ca mediante un contador de centelleo líquido (Hidex SL 600, Hidex).

Las tasas de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) se midieron utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse XFe96 (Agilent Technologies, Texas, EE. UU.). Las placas de cultivo Seahorse V3 se recubrieron con 50 µg/ml de fibronectina. Posteriormente, se sembraron células Caco-2 a una densidad de 0,5 × 105 células por cm2 y se cultivaron durante dos días. Las células se privaron de suero durante la noche antes de la medición. Una hora antes de la serie, las células se lavaron una vez con PBS y se incubaron con medio Agilent Seahorse XF DMEM pH 7,4 (103575-100; con 5 mmol/l de HEPES, sin rojo fenol y piruvato de sodio, Agilent Technologies, Texas, EE. UU.) complementado con con 10 mmol/L de glucosa a 37 °C, sin CO2. Después de las mediciones basales, las células recibieron una inyección aguda de 8 mmol/L de butirato de Na, acetato de Na o propionato de Na, seguida de 2 μmol/L de oligomicina A y una mezcla de 0,5 μmol/L de rotenona y 0,5 μmol/L de antimicina. A. Un ciclo de medición consistió en un tiempo de incubación de 3 min y un tiempo de medición de 3 min. Los valores de OCR y ECAR se normalizaron al contenido de proteína total. Las tasas de producción de ATP se calcularon según lo descrito por White et al.51.

Las células se lisaron en tampón de lisis helado que contenía (en mmol/L): 50 Tris-HCl, 1 EGTA, 1 EDTA, 10 glicerofosfato de sodio, 1 ortovanadato de sodio, 10 fluoruro de sodio, 10 pirofosfato de sodio, 270 sacarosa y 150 NaCl con Triton X-100 al 1% (v/v) y un cóctel de los siguientes inhibidores de la proteasa: PMSF (1 mmol/L), aprotinina (1 µg/mL), leupeptina (5 µg/mL), pepstatina (1 µg/ ml). Las concentraciones de proteína se determinaron usando Bradford de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Las muestras se desnaturalizaron en tampón laemmli que contenía 100 mmol/l de ditiotreitol (DTT) durante 30 min a 37 °C, se sometieron a SDS-PAGE (20 µg) y se transfirieron a membranas de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon en leche descremada en polvo (NFDM) al 5 % (p/v) disuelta en solución salina tamponada con Tris (TBS)-T 1 × (TBS con Tween-20 al 0,1 % (v/v)) durante 45–60 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se inmunotransfirieron durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario (pAMPKα de conejo (Thr172) (1:1000, Cell Signaling Technologies, Danvers, EE. UU., n.° 2535), AMPKα de conejo (1:1000, Cell Signaling Technologies, Danvers, EE. UU. , n.º 5831), pS6K de conejo (Thr389) (1:1000, Cell Signaling Technologies, Danvers, EE. UU., n.º 2708), conejo S6K (1:1000, Cell Signaling Technologies, Danvers, EE. UU., n.º 9234). ampliamente caracterizadas y se encuentran entre las más utilizadas en el campo, las membranas se cortaron antes de la hibridación con anticuerpos para ahorrar materiales.Esto se realizó de tal manera que los bordes tenían aproximadamente 20 kDa del tamaño esperado de la proteína de interés Al día siguiente, las transferencias se lavaron tres veces en TBS-T para eliminar el anticuerpo primario no unido y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (PO α-rabbit 1:10,000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. ) durante 1 h a temperatura ambiente, después de tres lavados con TBS-T, las proteínas se visualizaron con reactivo quimioluminiscente (SuperSignal West femto/pico, Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.) y se procesaron con Bio-Rad Chemidoc XRS. Se determinó el tiempo de exposición óptimo y se aplicó a cada transferencia específicamente para evitar la subexposición o la sobreexposición. Las densidades de bandas se cuantificaron con análisis densitométrico utilizando el software Image J (versión 2.0).

Las células HEK293 se transfectaron con 0,5 μg de plásmido TRPM7 de ratón (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP) y 0,5 μg de plásmido TRPM6 humano (HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en una proporción de ADN:lipofectamina de 1:2 durante 36 –48 h. Para transfecciones individuales, las células HEK293 se transfectaron con 1 μg de TRPM6 humano (HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) o 1 μg de TRPM7 de ratón (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en una proporción de ADN:lipofectamina de 1:2 para 36–48 h. Antes del inicio de los experimentos, las células se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con 50 μg/mL de fibronectina (Roche, Mannheim, Alemania). Las células se colocaron en la cámara de registro a temperatura ambiente y se seleccionaron en función de la intensidad del indicador fluorescente (GFP). Todos los experimentos se realizaron y analizaron utilizando un amplificador EPC-10 y el software Patchmaster (HEKA ElectroniK GmbH, Lambrecht, Alemania). El intervalo de muestreo se fijó en 200 ms y los datos se filtraron en paso bajo a 2,9 kHz. Las pipetas con abrazadera de parche se extrajeron de vidrio de borosilicato de pared delgada (Harvard Apparatus, March-Hugstetten, Alemania) y tenían una resistencia de entre 1 y 3 MΩ cuando se llenaron con la solución de pipeta que contenía 150 mmol/L de NaCl, 10 mmol/L de Na2EDTA y 10 mmol/L HEPES, pH 7,3 ajustado con NaOH. La solución extracelular contenía 150 mmol/L de NaCl, 10 mmol/L de HEPES y 1 mmol/L de CaCl2, pH 7,4 ajustado con NaOH. Se prepararon soluciones madre de butirato de sodio de 400 mmol/l en MilliQ (MQ), con una concentración final de butirato de sodio de 8 mmol/l en la solución de la pipeta. La compensación de resistencia en serie se fijó en 75–95 % en todos los experimentos. A partir de un potencial de retención de 0 mV, se aplicó una rampa de tensión lineal de 500 ms desde -100 hasta +100 mV cada 2 s. Las densidades de corriente se obtuvieron normalizando la amplitud de corriente a la capacitancia de la celda utilizando el software Igor Pro (Wavemetrics, Oregon, EE. UU.). Los gráficos de barras muestran las densidades de corriente obtenidas a + 80 y − 80 mV 200 s después de entrar en la celda.

Los resultados se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). A menos que se indique lo contrario, las comparaciones entre dos grupos se analizaron mediante la prueba t de Student no pareada, después de probar la distribución normal mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Debido a la naturaleza de medición repetida del analizador Seahorse, estos se probaron específicamente con una prueba t de Student pareada. Las comparaciones de más de dos grupos se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Dunnett o Sidak para corregir las comparaciones múltiples. Los análisis de correlaciones se realizaron mediante regresión lineal simple. Se utilizó GraphPad Prism (versión 8) para realizar los análisis estadísticos.

Los datos sin procesar que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos a Desirée Bos del departamento de Radiología y Medicina Nuclear, centro médico de la universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos, y a Daan Panneman del departamento de Laboratorio Metabólico Traslacional, centro médico de la universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos por su asistencia técnica con el magnesio verde. experimentos y mediciones de caballitos de mar. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (J. Hoenderop, NWO VICI 016.130.668 y J. de Baaij, NWO VENI 016.186.012).

Estos autores contribuyeron por igual: Jeroen HF de Baaij y Joost GJ Hoenderop.

Departamento de Fisiología, Radboud Institute for Molecular Life Sciences (RIMLS), Radboud University Medical Center (Radboudumc), PO Box 9101, 6500 HB, Nijmegen, Países Bajos

Lisanne MM Gommers, Pieter A. Leermakers, Jenny van der Wijst, Sara R. Roig, Anastasia Adella, Melissa AE van de Wal, René JM Bindels, Jeroen HF de Baaij y Joost GJ Hoenderop

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investigación diseñada por LMMG, JvdW, JHFdB y JGJH; LMMG, JvdW, SRR, PAL, RJMB, JHFdB y JGJH analizaron e interpretaron los datos; LMMG, JvdW, SRR, MvdW y AA realizaron investigaciones; LMMG, JvdW, PAL, JHFdB y JGJH escribieron el artículo; Todos los autores tuvieron acceso a los datos del estudio y revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Joost GJ Hoenderop.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gommers, LMM, Leermakers, PA, van der Wijst, J. et al. El butirato reduce la absorción celular de magnesio independientemente de la regulación metabólica en las células de colon humano Caco-2. Informe científico 12, 18551 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21683-6

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Recibido: 01 Marzo 2022

Aceptado: 30 de septiembre de 2022

Publicado: 03 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21683-6

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